Kategorie
SDS-PAGE (Abkürzung für englisch sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese) ist eine Variante der Polyacrylamid-Gelelektrophorese, einer analytischen Methode der Biochemie zur Trennung von Stoffgemischen nach der Molekülmasse in einem elektrischen Feld.
Einsatzbereich
Die SDS-PAGE wird zur Analyse von Proteinen verwendet. Als Trennmedium (auch als Matrix bezeichnet) bei dieser Art der Elektrophorese dient ein diskontinuierliches Gel auf Polyacrylamidbasis. Zusätzlich kommt SDS (Natriumdodecylsulfat) zum Einsatz. Dieses anionische Tensid (Detergens) überdeckt die Eigenladungen von Proteinen. Pro Gramm Protein binden ungefähr 1,4 Gramm SDS, sodass die Proteine eine konstante negative Ladungsverteilung aufweisen. Die negativen Ladungen des SDS führen zu einer gegenseitigen Abstoßung, was zusammen mit der Denaturierung durch Aufkochen zu einer Linearisierung der Proteine führt. Dies erlaubt eine Auftrennung nach der Kettenlänge, proportional zur Molekülmasse, denn die längeren Proteine werden im Gel stärker zurückgehalten als kürzere Proteine. Die Eigenladungen der Proteine sind unter der SDS-Beladung vernachlässigbar, die positiven Ladungen sind zudem im basischen pH des Gels stark verringert.
Verfahren
Bei der Probenvorbereitung wird SDS im Überschuss zu den Proteinen hinzugegeben und die Probe anschließend auf 95 °C erhitzt, um Sekundär- und Tertiärstrukturen durch das Unterbrechen von Wasserstoffbrücken und das Strecken der Moleküle aufzubrechen. Optional können Disulfidbrücken durch Reduktion gespalten werden. Dazu werden reduzierende Thiole wie β-Mercaptoethanol, Dithiothreitol (DTT) oder Dithioerythrit (DTE) dem Probenpuffer zugesetzt. Am Ende dieser Präparation weisen die mit SDS beladenen Proteine eine ellipsoide Form auf. Wegen des starken Denaturierungseffekts können in der Regel mit SDS keine Proteine mit Quartärstruktur bestimmt werden. Ausnahmen bilden z. B. zuvor durch kovalente Quervernetzung stabilisierte Proteine und die sogenannten SDS-resistenten Proteinkomplexe, welche auch in Gegenwart von SDS stabil sind (Letztere jedoch nur bei Raumtemperatur). Die SDS-Resistenz basiert auf der Metastabilität. Um die resistenten Komplexe zu denaturieren, ist eine hohe Aktivierungsenergie erforderlich. Obwohl das native, vollständig gefaltete Protein unter den Bedingungen keine ausreichende Stabilität besitzt, stellt sich das chemische Gleichgewicht der Denaturierung nur langsam ein. Stabile Proteinkomplexe zeichnen sich neben der SDS-Resistenz auch noch durch Stabilität gegen Proteasen und eine erhöhte biologische Halbwertszeit aus.[1]
Zur Auftrennung werden die denaturierten Proben auf ein Gel aus Polyacrylamid geladen, das in geeignete Elektrolyten eingelegt ist. Danach wird eine elektrische Spannung angelegt, die eine Migration der negativ geladenen Proben durch das Gel bewirkt. Das Gel wirkt dabei wie ein Sieb. Kleine Proteine wandern relativ leicht durch die Maschen des Gels, während große Proteine eher zurückgehalten werden und dadurch langsamer durch das Gel wandern. Am Ende des Vorganges sind alle Proteine nach Größe sortiert und können durch weitere Verfahren (Färbungen wie z. B. die Coomassiefärbung oder die Silberfärbung, immunologische Nachweise wie z. B. beim Western Blot) sichtbar gemacht werden. Zusätzlich zu den Proben wird meistens ein Größenmarker auf das Gel geladen. Dieser besteht aus Proteinen von bekannter Größe und ermöglicht dadurch die Abschätzung der Größe der Proteine in den eigentlichen Proben.
Das am häufigsten eingesetzte Verfahren ist die diskontinuierliche SDS-PAGE. Bei dieser wandern die Proteine zuerst in ein Sammelgel mit neutralem pH, in dem sie aufkonzentriert werden und anschließend in ein Trenngel mit basischem pH, in dem die eigentliche Auftrennung erfolgt. Sammel- und Trenngel unterscheiden sich durch unterschiedliche Porengröße und pH-Werte. Der pH-Gradient zwischen Sammel- und Trenngelpuffer führt zu einem Stapelungseffekt an der Grenze zum Trenngel. Als Elektrolyt wird häufig ein SDS-haltiges TRIS-Glycin-Puffersystem eingesetzt. Dieses von Ulrich Laemmli entwickelte diskontinuierliche System ermöglicht eine gute Trennung der Proteine.[2] Die Publikation, in der es beschrieben wurde, ist das am häufigsten zitierte Paper eines Einzelautors, und das zweithäufigst zitierte insgesamt.[3] Zur Trennung von kleinen Proteinen und Peptiden eignet sich aufgrund der höheren Spreizung der Proteine im Bereich von 5 - 50 KDa das TRIS-Tricin-Puffersystem von Schägger und von Jagow.[4] Glykoproteine adsorbieren SDS an den Glykosylierungen ungleichmäßiger, was in breiteren und unschärferen Banden resultiert.
Kommerzielle Gelsysteme
Kommerzielle Gelsysteme (so genannte pre-cast-Gele) verwenden meist die Puffersubstanz BisTris mit einem pH-Wert von 6,4 sowohl im Sammel- als auch im Trenngel. Diese Gele werden bereits fertig gegossen geliefert und sind umgehend einsatzbereit. Der niedrigere pH-Wert verhindert den Zerfall des Polyacrylamids und macht die Gele über längere Zeit lagerfähig. Zusätzlich besitzt dieses Gelsystem einen sehr großen Auftrennungsbereich, der zusätzlich durch Verwendung von MES oder MOPS im Laufpuffer variiert werden kann.
Siehe auch
- Elektrophorese
- Gelelektrophorese
- 2D-Gelelektrophorese
- Nativ-PAGE
- QPNC-PAGE
- Densitometrie
Einzelnachweise
- ↑ M. Manning, W. Colón: Structural basis of protein kinetic stability: resistance to sodium dodecyl sulfate suggests a central role for rigidity and a bias toward beta-sheet structure. In: Biochemistry. Bd. 43, 2004, S. 11248–11254, PMID 15366934.
- ↑ U. K. Laemmli: Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. In: Nature. Bd. 227, 1970, S. 680–685, doi:10.1038/227680a0, PMID 5432063.
- ↑ www.nzzfolio.ch: Interview mit Ulrich Lämmli. NZZ Folio, Nr. 11, 2005. Abgerufen am 4. März 2012.
- ↑ H. Schägger, G. von Jagow: Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. In: Anal. Biochem. Bd. 166, 1987, S. 368–379, doi:10.1016/0003-2697(87)90587-2, PMID 2449095.
Weblinks
- OpenWetWare: Protokoll für BisTris SDS-PAGE
