Proteinreinigung


Proteinreinigung

Proteinreinigung (auch Proteinaufreinigung) bezeichnet den Vorgang, aus einem komplexen biologischen Gemisch oder einer Lösung, die mehrere Biomoleküle enthält, eines oder mehrere Proteine anzureichern und aufzureinigen. Diese Anreicherung kann in mehreren, aufeinanderfolgenden Reinigungsschritten durch Anwendung unterschiedlicher Reinigungsmethoden erfolgen, deren Effektivität (die sinnvolle Aufeinanderfolge) und deren Effizienz (der Reinigungsgrad), mit analytischen Methoden verfolgt und quantifiziert wird.

Trennprinzipien

Um Proteine zu trennen, nutzt man ihre durch die Sequenz und spezifische Struktur bedingten unterschiedlichen Merkmale aus. Bei der Ionenaustauschchromatographie und der isoelektrischen Fokussierung ist dies der isoelektrische Punkt, bei der SDS-PAGE die Molekülmasse und posttranslationale Modifikationen, bei der Größenausschlusschromatographie und bei der Zentrifugation die Molekülmasse und Konformation. Die isopyknische Zentrifugation separiert anhand der Dichte. Die Affinitätschromatographie nutzt die Unterschiede in der Affinität zu einem selektiven Liganden bzw. in den jeweiligen Dissoziationskonstanten. Die hydrophobe, die Umkehrphasen- und die polare Chromatographie trennen nach der Polarität der verschiedenen exponierten polaren Aminosäuren und posttranslationalen Modifikationen. Die Fällung mit kosmotropen Salzen[1] aus der Hofmeister-Reihe, wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln oder Temperatur beruht auf den veränderten Löslichkeiten. Die Extraktion mit einem Extraktionsmittel (meistens eine andere Phase) oder Polyethylenglykol[1] basieren auf der Polarität und den unterschiedlichen Löslichkeiten in einem Lösungsmittel oder Detergens, wie z. B. Mischungen von Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol (mit oder ohne Chaotrope wie Guanidiniumthiocyanat[2]) oder die Phasentrennung von einprozentigen (m / V) Lösungen von Triton X-114 bei 4 °C.[3][4][5][6]

Meistens werden mehrere Methoden seriell durchgeführt, die Auswahl der Methode richtet sich dabei nach den Eigenschaften des Proteins, den jeweiligen Methoden-abhängigen störenden Begleitsubstanzen für anschließende Verfahren und einer eventuell einhergehenden Denaturierung. Höhere Reinigungsgrade (bzw. Aufreinigungsfaktoren) eines Verfahrens ermöglichen eine geringere Anzahl an Aufreinigungsschritten, z. B. bei der Tandem Affinity Purification.

Da aufzureinigende Proteine, meistens rekombinante Proteine, bei Zellaufschluss durch Inaktivierung, Denaturierung oder Proteolyse gefährdet sind, wird eine Proteinreinigung oftmals zügig bei 4 °C in Anwesenheit von Proteaseinhibitoren durchgeführt. Einige Proteaseinhibitoren werden nur verwendet, sofern die Funktion des aufzureinigenden Proteins nicht gemindert wird oder ein Erhalt dessen Funktion unerheblich ist, da sie das Protein über eine kovalente Bindung modifizieren können.

Trennverfahren

Chromatographie

Elektrophorese

Extraktion & Fällung

Filtration

Sedimentation

Evaporation

  • Lyophilisation

Nachweisverfahren

Nach den einzelnen Etappen einer Proteinreinigung erfolgt eine Charakterisierung und Quantifizierung der aufgereinigten Proteine. Die Effizienz der gesamten Aufreinigung wird durch die Bilanz bestimmt, wobei ein Aufreinigungsgrad (als Kehrwert des Massenanteils) aus der Proteinmasse, oder – bei Enzymen – auch ein Aufreinigungsgrad aus den Enzymaktivitäten bestimmt werden kann, z. B. der Quotient aus der Gesamtmasse an aufgereinigtem Protein und der Ausgangsmasse des betrachteten Proteins im Ausgangsmaterial oder der analoge gebildete Quotient mit den Aktivitäten.

Literatur

  • Friedrich Lottspeich, Haralabos Zorbas: Bioanalytik. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 1998, ISBN 978-3827400413.
  • Hubert Rehm, Thomas Letzel: Der Experimentator: Proteinbiochemie / Proteomics. 6. Auflage, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 2009, ISBN 978-3827423122.

Weblinks

Einzelnachweise

  1. 1,0 1,1 J. Wen, S. Zhao, D. He, Y. Yang, Y. Li, S. Zhu: Preparation and characterization of egg yolk immunoglobulin Y specific to influenza B virus. In: Antiviral Res. (2012) 93(1):154-9. PMID 22127067.
  2. P. Chomczynski, N. Sacchi: Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. In: Anal Biochem. (1987) 162(1):156-9. PMID 2440339.
  3. H. Everberg, N. Gustavasson, F. Tjerned: Enrichment of membrane proteins by partitioning in detergent/polymer aqueous two-phase systems. In: Methods Mol Biol. (2008) 424:403-12. Review. PMID 18369878.
  4. P. O. Magalhães, A. M. Lopes, P. G. Mazzola, C. Rangel-Yagui, T. C. Penna, A. Pessoa Jr.: Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review. In: J Pharm Pharm Sci. (2007) 10(3):388-404. Review. PMID 17727802.
  5. M. Wetterhall, G. Shevchenko, K. Artemenko, M. Ö. Sjödin, J. Bergquist: Analysis of membrane and hydrophilic proteins simultaneously derived from the mouse brain using cloud-point extraction. In: Anal Bioanal Chem. (2011) 400(9):2827-36. PMID 21553125.
  6. R. A. Mathias, Y. S. Chen, E. A. Kapp, D. W. Greening, S. Mathivanan, R. J. Simpson: Triton X-114 phase separation in the isolation and purification of mouse liver microsomal membrane proteins. In: Methods. (2011) 54(4):396-406. PMID 21272644.