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Western Blot

Western Blot (Westernblot), auch Immunblot (engl. Immunoblot) bezeichnet die Übertragung (engl. Blotting) von Proteinen auf eine Trägermembran, die anschließend über unterschiedliche Reaktionen nachgewiesen werden können. Die Übertragung kann auf unterschiedliche Weise durchgeführt werden: mittels Diffusion, Kapillarwirkung oder Elektrophorese. Anwendung findet der Western Blot in der biochemischen und medizinischen Forschung sowie in der Diagnostik.

Die Western Blot-Methode wurde ursprünglich 1979 im Labor von George R. Stark an der Universität Stanford entwickelt.[1] Im selben Jahr konnten Harry Towbin und Mitarbeiter das Verfahren wie im einfacheren Southern Blot auf Nitrocellulose umstellen,[2] was auch heutzutage die einfachere und präferierte Methode ist.

Die Bezeichnung des Blot-Verfahrens („Western Blot“) stammt vom englischen blot für Klecks oder Fleck und von engl. blotting paper für Löschpapier, bei dem auch ein identischer Abdruck des Originals entsteht. Diese wurde erstmals 1981 von Neal Burnette[3] als eine Allusion eingeführt.[4] Edwin Southern gilt als der Erfinder der Blotting-Technik. Im Jahr 1975 entwickelte er eine Methode für die Auftrennung von DNA-Fragmenten und nachfolgende Hybridisierung, die er als Southern Blot bezeichnete. Die entsprechende Auftrennung von RNA-Fragmenten wurde in Anlehnung an seinen Namen als Northern Blot bezeichnet. Daher nannte man das Proteinblotting mit SDS Western Blot.

Einen Eastern Blot per se gibt es nicht. Dennoch wird der Ausdruck „Eastern Blot“ für verschiedene Methoden in Anspruch genommen, z. B für eine elektrophoretische Auftrennung und einen Transfer der Proteine auf Membranen mit einem kationischen Detergens (z. B. CTAB[5][6] oder 16-BAC[7]), bei dem die Proteine in die entgegengesetzte Richtung (zur Kathode) wandern. Der Ausdruck Eastern Blot wurde auch für das Blotten von Lipiden auf Membranen, den Transfer nativer Proteine aus nichtdenaturierenden Gelen oder das Auftropfen (engl. Blotting) von Molekülen verwendet.[8]

Prinzip

Westernblot einer Nitrozellulosemembran, an die Proteine in unterschiedlichen Mengen (von links: 17 ng, 13 ng, 11 ng, 8 ng, 4 ng) fixiert wurden. Die Detektion erfolgte mit Hilfe eines zweiten Antikörpers, an den das Enzym Meerrettichperoxidase(HRP) gekoppelt wurde. Durch Chemolumineszenz wurde ein Film belichtet und entwickelt. Die Lumineszenzreaktion erfolgte in einer Lösung von 100 mM TRIS/HCl pH 6,8; 0,2 mM p-Cumarsäure (in Dimethylsulfoxid gelöst); 1,2 mM Luminol (Natriumsalz, in Dimethylsulfoxid gelöst) und 0,01 % (V/V) Wasserstoffperoxid.

Vor dem eigentlichen Western Blot wird ein Proteingemisch mit Hilfe einer Gel-Elektrophoresetechnik in einer Trägermatrix (SDS-PAGE, Nativ-PAGE, isoelektrische Fokussierung, 2D-Gelelektrophorese, usw.) entsprechend ihrer Größe, Ladung oder anderer Eigenschaften aufgetrennt. Hierbei werden die zu untersuchenden Proteine zuerst per Gelelektrophorese (in der Regel ein Polyacrylamid-Gel mit optimaler Acrylamid-Konzentration) in Proteinbanden aufgetrennt.

Proteintransfer

Beim Western Blot wird ein senkrecht zum Polyacrylamid-Gel gerichtetes elektrisches Feld angelegt (Elektrotransfer), wodurch die Proteine in Richtung der Anode wandern. Sofern kein Zeitdruck besteht, kann der Transfer alternativ durch Kapillarwirkung in Richtung eines trockenen Stapels eines hydrophilen, adsorbierenden Materials erfolgen (Kapillartransfer). Beim Transfer wandern die Proteine aus dem Gel auf eine Membran, z. B. Nitrocellulose, Nylon, Glasfaser oder meistens Polyvinylidenfluorid (PVDF). Bei Nylon oder PVDF bleiben Proteine aufgrund hydrophober und polarer Wechselwirkungen an der Membranoberfläche haften, während die Adsorption bei Nitrocellulose oder Glasfasern über ionische und polare Wechselwirkungen erfolgt. Beim Transfer bleibt das Muster der elektrophoretischen Auftrennung erhalten. Die Proteine sind nun aber für weitere Methoden zugänglich (z. B. Bindung eines Immunkonjugats). Nach diesem Vorgang kann das an den Proteinen angelagerte SDS ausgewaschen werden. Daher können die Proteine renaturieren und teilweise ihre Sekundär- und Tertiärstruktur wieder einnehmen, aufgrund der räumlichen Trennung der verschiedenen Untereinheiten eines Proteins kann die Quartärstruktur so jedoch nicht wiederhergestellt werden. Zur Bestimmung der Anzahl und Größe der Untereinheiten eines Proteins kann jedoch vor der SDS-PAGE eine kovalente Vernetzung der Untereinheiten durchgeführt werden, die ein Aufkochen in Probenpuffer für die SDS-PAGE übersteht und nach einer Immunfärbung den Aufbau eines Proteinkomplexes aufzeigen kann. Für die elektrophoretische Übertragung werden zwei unterschiedliche Systeme verwendet: das Tank-Blot-System und das Semidry-Blot-System, die sich in Aufbau und eingesetzten Puffermengen und -systemen unterscheiden.

Proteindetektion

Strukturformel von Amidoschwarz, dessen Natriumsalz Amidoschwarz 10 B als Farbstoff eingesetzt wird

Die temporäre Anfärbung aller Proteine auf der Blotmembran erlaubt eine Überprüfung des Transfers vor einer Immundetektion. Die Gesamtheit der membrangebundenen Proteine kann über bestimmte Farbstoffe wie Ponceau S, Kolloidales Gold, Amidoschwarz oder Tusche unselektiv markiert werden. Andere Farbstoffe sind in der Lage, posttranslationale Modifikationen wie z. B. phosphorylierte Proteine zu markieren. Die bei der SDS-PAGE häufig verwendeten Färbungen wie die Coomassie-Färbung oder die Silberfärbung erlauben nur eine geringe Renaturierung der Proteine während der Entfärbung vor einer Immundetektion und entfärben zudem unvollständig. Je nach Versuchsaufbau können anschließend selektiv einzelne Proteine sichtbar gemacht werden, z. B. radioaktiv markierte Antikörper oder andere Proteine, die durch den Einbau von Isotopen bei der Proteinsynthese oder durch nachträgliche Phosphorylierung radioaktiv markiert werden, bei Enzymen durch Umsetzen eines entsprechenden Substrats oder die im Folgenden erwähnte Immundetektion. Bei Verwendung vorgefärbter Größenmarker (also gefärbte Proteine bekannter Größen) entfällt die reversible Proteinfärbung, da der gesamte Proteintransfer erfolgreich war, wenn der Marker auf die Membran übertragen wurde.

Immundetektion einzelner Proteine

Die Proteinbanden werden meistens auf der Membran mit Hilfe spezifischer Antikörper identifiziert. Spezifische Antikörper (monoklonal) oder Mischungen von spezifischen Antikörpern (polyklonal) binden an der passenden Proteinbande auf der Membran. Unspezifisch gebundene Antikörper werden aufgrund von Waschschritten mit Puffern, die Detergentien enthalten, wieder entfernt. Dabei macht man sich die Affinität der Bindung zwischen Antigen und Antikörper zunutze: Ein antigenspezifischer Primärantikörper bindet an „sein“ Epitop auf dem räumlich von den anderen Proteinen getrennten Antigen mit einer charakteristischen Molmasse. Weil die Renaturierung nicht vollständig ist, können bei der Verwendung monoklonaler Antikörper, die ein diskontinuierliches Epitop (synonym: Konformationsepitop) am Protein erkennen, Probleme auftreten. Mit Antikörpern, die ein kontinuierliches Epitop (synonym: Sequenzepitop) erkennen können, ist eine Renaturierung nicht erforderlich.

Die Detektion erfolgt meistens mit einem Immunkonjugat. An die Fc-Region des primären Antikörpers bindet ein sekundärer Antikörper als Antikörperkonjugat (Immunkonjugat) mit einem Reporterenzym, über das nach weiteren Waschschritten die Detektion erfolgt. Die Verwendung eines Sekundärantikörper-Konjugats anstelle eines Primärantikörper-Konjugats erlaubt dessen modulare Verwendung bei verschiedenen Primärantikörpern mit einhergehender Kostenersparnis, da die Kopplung jedes einzelnen Primärantikörpers mit einem Reporterenzym entfällt. Weiterhin kommt es durch den Sekundärantikörper zur Signalverstärkung, da der polyklonale, gegen mehrere Epitope auf dem Fc-Fragment einer Spezies gerichtete Sekundärantikörper an mehrere Stellen im Fc-Bereich aller Primärantikörper einer Art binden kann und dort viele Reporterenzyme gruppiert. Reporterenzym-Antikörperkonjugate (-Immunkonjugate) sind im Handel erhältlich.

Je nach Fragestellung kann beim Immunblot – wie unten beschrieben - das Antigen oder – wie z. B. beim HIV-Test – auch der Primärantikörper das Suchobjekt sein. Auch Antikörper sind Proteine, und daher kann man ihre antigenen Eigenschaften neben dem Western Blot auch z. B. im Immunblot, ELISPOT und ELISA sichtbar machen.

Ablauf

Ein typischer Western Blot kann folgendermaßen aussehen:

  • Nach dem Transfer (SDS-PAGE und Blot) der Proteine auf die Membran müssen zuerst die freien unspezifischen Proteinbindungsstellen auf der Membran blockiert werden, da sich sonst die Antikörper an diese Bindungstellen heften und einen spezifischen Nachweis von Antigenen unmöglich machen würden. Das Blockieren der freien Bindungsstellen erfolgt mit einem für die Antikörper nicht erkennbaren Protein oder chemischen Polymer. Dafür eignen sich Lösungen von entfettetem Milchpulver, Rinderserumalbumin (BSA, bovine serum albumin), Gelatine und andere Proteine oder auch Lösungen von Polyvinylpyrrolidon mit einem milden Detergens.[9][10] Wurde zusätzlich zu den zu untersuchenden Proteinen ein ungefärbter Größenmarker (synonym: Komigrationsstandard) verwendet, sollte zuerst eine reversible Färbung aller Proteine auf der Membran mit z. B. Ponceau S erfolgen. Die anschließend sichtbaren Markerbanden können mit mechanischen Druck auf die Membran erhalten werden und so auch noch nach der Farbreaktion zur Proteinidentifizierung herangezogen werden. Bei vorgefärbten Größenmarkern entfällt die reversible Proteinfärbung.
  • Die Membran wird nun mit einer verdünnten Antikörper-Lösung behandelt, wobei die Antikörper spezifisch gegen ein Protein oder auch gegen mehrere Proteine auf der Membran gerichtet sind.
  • Einige Waschschritte mit einer Detergenslösung entfernen schwächer haftende, unspezifisch gebundene Antikörper von der Membran. Eine zweite Antikörperlösung (mit dem Sekundär-Antikörper) wird auf die Membran gegeben, deren Antikörper spezifisch gegen bestimmte Bereiche des ersten Antikörpers gerichtet sind (in der Regel die Fc-Region des Antikörpers) und an diese Bereiche binden.
Schema der Immundetektion. Der primäre Antikörper bindet an sein Antigen, welches auf einer Membran fixiert ist. An diesen wiederum bindet der sekundäre Antikörper, der z. B. mit dem Enzym HRP gekoppelt ist. HRP katalysiert die Umsetzung von Luminol oder anderen Dioxetanen in seine oxidierte Form, dessen Lumineszenz detektiert werden kann.
  • Nach weiteren Waschschritten erfolgt nun je nach Detektionsmethode die Sichtbarmachung. Bei Enzym-Immunkonjugaten wird durch das Enzym eine Farb- oder Chemolumineszenzreaktion katalysiert. Ein häufig an sekundäre Antikörper gekoppeltes Enzym ist beispielsweise die Meerrettichperoxidase (HRP, horseradish peroxidase, also eine Peroxidase aus dem Meerrettich). Die HRP katalysiert die Umsetzung von präzipitierenden Farbstoffsubtraten (TMB, DAB, ABTS, AEC), wodurch ein Auflegen eines Films wie bei der Autoradiographie oder Chemolumineszenz entfällt. Ebenso überführt die HRP aber auch Luminol (oder andere Dioxetane) in seine oxidierte Form, bei der eine Chemolumineszenz entsteht und auf Röntgenfilmen detektiert werden kann. Auch alkalische Phosphatasen (AP, engl. alkaline phosphatase) werden häufig verwendet, jedoch sollte dabei wegen einer reversiblen Hemmung der Phosphatase auf phosphathaltige Puffer (z. B. phosphatgepufferte Salzlösung) verzichtet werden. Der Nachweis erfolgt dabei durch eine Farbreaktion mit den präzipitierenden Farbstoffsubstraten BCIP mit NBT oder Naphtol-AS-MX-Phosphat mit Fast Red TR. Bei radioaktiv markierten Zweitantikörpern erfolgt der Nachweis durch Autoradiographie auf Röntgenfilmen. Weiterhin existieren auch Sekundär-Antikörper mit Fluoreszenzkonjugaten, die an speziellen Scannern direkt und detektiert und auch quantifiziert werden können. Hierbei können dann auch Doppelmarkierungen auf derselben Membran durchgeführt werden, wenn zwei unterschiedliche Primär-Antikörper (z. B. aus der Maus und der Ziege) unterschiedlicher Spezifität mit den entsprechenden Sekundär-Antikörper (z. B. Anti-Maus IgG und Anti-Ziege IgG) mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen eingesetzt werden. Auch Peroxidase- und Phosphatase-Antikörper können, bei gleichzeitiger Inkubation mit dem Blot und unterschiedlichen anschließenden Farbreaktionen, zur Doppeldetektion verwendet werden, wenn sie Primärantikörper unterschiedlicher Spezies erkennen. Da die Peroxidase nach einer Detektion durch Zugabe von verdünnten Natriumazid-Lösungen irreversibel inaktiviert werden kann, ist nach Inaktivierung und Herauswaschen des ungebundenen Natriumazids, auch eine serielle Doppeldetektion ausschließlich mit Peroxidasekonjugaten als Sekundärantikörper möglich.

Immunblot vs. (EL)ISA

Beides sind Methoden, die zum Nachweis von Antigenen (Proteinen) mit Hilfe markierter Antikörper dienen: Beide sind damit ISAs (Immunosorbent Assay), Methoden aus dem Bereich der Proteomik.

Der Immunblot erweitert den ELISA gewissermaßen um die Dimension der elektrophoretischen Auftrennung auf Kosten einer selektiven Anreicherung der Antigene durch Coating-Antikörper. Diese fehlende Anreicherung kann durch eine zusätzliche Proteinreinigung oder eine Immunpräzipitation erreicht werden. Durch die Gelelektrophorese und die Fixierung auf einem Festmedium (der Blotmembran) stehen den Antikörpern an verschiedenen, definierten Orten unterschiedliche Antigene getrennt zur „Auswahl“: Ein einziger Immunblot kann z. B. ein Serum mittels einer Vielzahl aufgeblotteter Antigene auf ebendiese Vielzahl an zugehörigen Antikörpern überprüfen, jedoch werden aufgrund der Denaturierung während der Probenvorbereitung zur SDS-PAGE fast ausschließlich kontinuierliche Epitope (synonym Sequenzepitope) nachgewiesen. Durch die räumliche Auftrennung können ebenso mehrere Bestandteile, gegen die ein Serum Antikörper enthält, parallel und selektiv nachgewiesen werden. Dieser Effekt kann durch Seren von Immunisierten oder Rekonvaleszenten (polyklonal) oder auch durch Mischungen von monoklonalen Antikörpern erreicht werden.

Anwendungen

Im Bereich der Proteinbiochemie dient der Western Blot zum Nachweis von bestimmten Proteinen und Protein-Veränderungen, z. B. Phosphorylierung. Es kann auch eine semiquantitative Analyse durchgeführt werden (Probe A enthält mehr Protein X als Probe B), mit dem Auftrag einer Verdünnungsreihe einer bekannten Proteinkonzentration kann die Abschätzung der Menge auf dem Blot etwas genauer verglichen werden.

Im Bereich der Medizin dient das Western Blotting dem Nachweis diagnostisch relevanter Proteine, so zum Beispiel von Antikörpern im Serum, welche für das Vorliegen bestimmter Infektionskrankheiten typisch sein können. Mittels des Western Blots kann man Teststreifen herstellen, um z. B. Antikörper gegen bestimmte Viren im Serum nachzuweisen. Außerdem hilft diese Methode in der medizinischen Forschung bei der Suche nach krankheitsrelevanten Proteinen z. B. dem BSE-Erreger oder HIV. Auch Proteine wie die ERK, die gehäuft in Tumoren vorkommen, können über Western Blot quantifiziert und entartete Zellen hierdurch erkannt werden. Hiermit kann z. B. bestimmt werden, inwiefern sich bestimmte Medikamente regulativ auf die vermehrte Expression solcher Proteine in der Zelle auswirken und somit eine regulative Wirkung auf das weitere Wachstum der Tumorzellen haben.

Einzelnachweise

  1. Renart, J. et al. (1979): Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure. In: Proc. Natl. Acad. Sci. USA Bd. 76(7), S. 3116–3120. PMID 91164. PDF (freier Volltextzugriff)
  2. Towbin, H. et al. (1979): Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. In: Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. Bd. 76(9), S. 4350–4354. PMID 388439 PDF (freier Volltextzugriff)
  3. Burnette, W.N. (1981): Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. In: Anal. Biochem. Bd. 112(2), S. 195–203. PMID 6266278; doi:10.1016/0003-2697(81)90281-5
  4. Citation's Classic: W. Neal Burnette
  5. E. Buxbaum: Cationic electrophoresis and electrotransfer of membrane glycoproteins, In: Anal. Biochem. 314:70-76 (2003), PMID 12633604.
  6. D. Akin, et al.: The determination of molecular weights of biologically active proteins by cetyltrimethylammonium bromide polyacrylamide gel electrophoresis, In: Anal. Biochem. 145:170-176 (1985), PMID 4003759.
  7. J. Hartinger, K. Stenius, D. Hogemann, R. Jahn: 16-BAC/SDS-PAGE : a two-dimensional gel electrophoresis system suitable for the separation of integral membrane Proteins, In: Anal. Biochem. 240:126-133 (1996), PMID 8811889.
  8. Tanaka H. et al. (2007): Eastern blotting and immunoaffinity concentration using monoclonal antibody for ginseng saponins in the field of traditional chinese medicines. J Agric Food Chem.; 55(10):3783–3787; PMID 17455950 PDF (freier Volltextzugriff)
  9. J. W. Haycock: Polyvinylpyrrolidone as a blocking agent in immunochemical studies. In: Anal Biochem. (1993), Band 208(2), S. 397-9. PMID 8095775.
  10. K. Klarskov, S. Naylor: India ink staining after sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis and in conjunction with Western blots for peptide mapping by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. In: Rapid Commun Mass Spectrom. (2002), Band 16(1), S. 35-42. PMID 11754245.

Literatur

Weblinks